Retno kelahiran Semarang, Jawa Tengah, pada 27 November 1962. Dia menempuh pendidikan menengah atasnya di SMA Negeri 3 Semarang sebelum akhirnya memperoleh gelar sarjana S-1 Ilmu Hubungan Internasional di Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta pada tahun 1985.
Setelah itu ia menempuh gelar S-2 Hukum Uni Eropa di Haagse Hogeschool, Belanda. Setelah lulus, ia bergabung dengan Kementerian Luar Negeri Indonesia.
Dari 1997 hingga 2001, Retno menjabat sebagai sekretaris satu bidang ekonomi di Kedutaan Besar Republik Indonesia di Den Haag, Belanda. Pada 2001, ia ditunjuk sebagai Direktur Kerja Sama Intra-Kawasan Amerika-Eropa. Retno dipromosikan menjadi Direktur Eropa Barat pada tahun 2003.
Retno menikah dengan Agus Marsudi, seorang arsitek, dan dikaruniai dua orang anak, yaitu Dyota Marsudi dan Bagas Marsudi.